eng version /иИнтеины и белковый сплайсинг
КОРОТКО: Белковым сплайсингом называется процесс, в результате которого внутренняя часть белка (интеин) пост-трансляционно вырезается, а фланкирующие ее последовательности (экстеины) лигируются. Одно из главных преимуществ интеинов - то что они сами катализируют свое вырезание и требуют присутствия каких-либо кофакторов или ферментов. Протекание белкового сплайсинга катализируется внутренним доменом самого интеина – т.н. Hint-доменом [a]
Основной целью нашей работы является создание химерных последовательностей - интеина, генно-инженерными методами слитого с целевым белком (в частности - с гормоном роста человека). В нашей работе мы используем модифицированный Mxe GyrA интеин, который соединяет аффинную метку с целевым белком.
Нами создано ряд таких конструктов. На одном из них - состоящего из короткого N-концевого пептида, интеина Mxe GyrA и целевого белка (гормона роста человека - HGH) на С-конце. Мы обнаружили что расщепление такого белка происходит in vitro, т.е. в пробирке. Но последующего сплайсинга - т.е. сшивки N-концевого пептида и гормона роста человека - не происходит. В результате мы получаем "отрезанный" HGH с нативным N-концом - на нем нету формил-метионина, что не удается получить обычным методами [b].
Следующим шагом нашей работы было введение в конструкт аффинной метки. Логика работы заключается в том, чтоб если метка будет распологаться либо на N-конце конструкта, либо в теле интеина, то последний после активации будет ее отрезать вместе с собой. Были испробованы обе возможности. Наиболее эффективным было размещение метки (целлюлозо-связывающего домена, или CBD) на N-конце. В середину интеина без нарушения его структуры и активности мы ввели минимальную метку - His-tag (обозначим такой интеин как intein*). В результате наилучший конструкт выглядел следующим образом: CBD-intein*-HGH [c]. Его использование позволило получать чистый HGH с нативным N-концом, используя всего 2 стадии очистки. Это значительно проще, чем использование традиционных методик.
МЕСТО ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ: Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ:
на основе интеина создано четыре различных химерных конструктов с HGH;
показана принципиальная возможность получения нативного и чистого HGH, используя всего две стадии очистки;
НАГРАДЫ:
Второе место на Конференции молодых ученых "Актуальные проблемы биохимии и биотехнологии - 2006", Киев, Украина.
ПУБЛИКАЦИИ:
На английском:
P.L. Starokadomskyy, O.V.
Starokadomskyy P.L., Okunev O.V., Dubey L.V. Utilizing of protein splicing phenomenon for optimization of obtaining and purification of the recombinant human growth hormone // Eur J Medic Res., 2006, Oct. 8,
Starokadomskyy P.L. Protein splicing // Molecular biology (Moscow), 2007, vol. 41, N2, p. 278-293 (PMID: 17514899)
Starokadomskyy P.L., Dubey I.Ya., Okunev O.V., Irodov D.M. Intein-containing chimeric protein construction and evaluation of its cleavage conditions // Cytology and Genetics, 2007, vol. 41, N2, p. 3-11 (PMID: 17494337)
Starokadomskyy P. L. Protein splicing and its evolution in eukaryotes // Biopolymers and
На русском/украинском:
Старокадомский П.Л., Окунев О.В., Дубей И.Я. Использование белкового сплайсинга для оптимизации получения и очистки рекомбинантных белков // Материалы Международной конференции «Генетика в России и мире», 28.06-2.07 2006, Москва, Россия, с. 192.
Старокадомський П. Л., Яворський В.Ю. Використання білкового сплайсингу для оптимізації отримання та очистки рекомбінантних білків // Тези конференції-конкурсу робіт молодих вчених «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2006», присвяченої 100-річчю з Дня народження Беліцера, 4-7 червня 2006, Київ, Україна, с. 29.
Старокадомский П.Л. Белковый сплайсинг (теория) // Молекулярная биология (Москва), 2007, том 41, N 2, c. 314–330.
Старокадомский П.Л. Белковый сплайсинг (теория, биотехнология) // Укр. биох. журн., 2005, №4, с.14-29. (PMID: 16568601)
Популярная статья:
1. Старокадомский П.Л. Белки против РНК — кто первым придумал сплайсинг?
РИСУНКИ ПО ТЕМЕ:
сравнительный анализ пространственного расположения боковых радикалов аминокислот активного центра сериновых протеаз и интеина Mxe GyrA, сделанный в нашей лаборатории.
схема белкового цис-сплайсинга 
схема белкового транс-спласинга
ПОЛЕЗНЫЕ ССЫЛКИ ПО ТЕМЕ:
InBase - веб-портал посвященный интеинам: теория, последовательности, библиография, ссылки. Сайт размещен на сайте New England Biolab. Координатор сайта - Dr Francine Perler, ведущий исследователей феномена белкового сплайсинга - http://www.neb.com/neb/inteins.html (прямая ссылка на лист моих публикаций на InBase - http://tools.neb.com/inbase/bibliog.php#starokadomskyy2005 )
База по интеинам и их гомологам (BIL's, Hedgehog), размещена на сайте лаборатории Shmuel Pietrokovski, Weizmann Institute, Israel. http://bioinformatics.weizmann.ac.il/~pietro/inteins/
Популярно о белковой сплайсинге - Biomolecula.ru
