eng version                      /иИнтеины и белковый сплайсинг

          Использование белкового сплайсинга для оптимизации получения и очистки рекомбинантных белков

КОРОТКО:   Белковым сплайсингом называется процесс, в результате которого внутренняя часть белка (интеин) пост-трансляционно вырезается, а фланкирующие ее последовательности (экстеины) лигируются. Одно из главных преимуществ интеинов - то что они сами катализируют свое вырезание и требуют присутствия каких-либо кофакторов или ферментов. Протекание белкового сплайсинга катализируется внутренним доменом самого интеина – т.н. Hint-доменом [a] . Это можно объяснить тем, что концы интеина складываются в структуру, гомологичную активному центру сериновых протеаз (трипсин, хемотрипсин).

Основной целью нашей работы является создание химерных последовательностей - интеина, генно-инженерными методами слитого с целевым белком (в частности - с гормоном роста человека). В нашей работе мы используем модифицированный Mxe GyrA интеин, который соединяет аффинную метку с целевым белком.

Нами создано ряд таких конструктов. На одном из них - состоящего из короткого N-концевого пептида, интеина Mxe GyrA и целевого белка (гормона роста человека - HGH) на С-конце. Мы обнаружили что расщепление такого белка происходит in vitro, т.е. в пробирке. Но последующего сплайсинга - т.е. сшивки N-концевого пептида и гормона роста человека - не происходит. В результате мы получаем "отрезанный" HGH с нативным N-концом - на нем нету формил-метионина, что не удается получить обычным методами [b].

Следующим шагом нашей работы было введение в конструкт аффинной метки. Логика работы заключается в том, чтоб если метка будет распологаться либо на N-конце конструкта, либо в теле интеина, то последний после активации будет ее отрезать вместе с собой. Были испробованы обе возможности. Наиболее эффективным было размещение метки (целлюлозо-связывающего домена, или CBD) на N-конце. В середину интеина без нарушения его структуры и активности мы ввели минимальную метку - His-tag (обозначим такой интеин как intein*). В результате наилучший конструкт выглядел следующим образом: CBD-intein*-HGH [c]. Его использование позволило получать чистый HGH с нативным N-концом, используя всего 2 стадии очистки. Это значительно проще, чем использование традиционных методик.

МЕСТО ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ: Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ:

НАГРАДЫ:

ПУБЛИКАЦИИ:

  На английском:

  1. P.L. Starokadomskyy, O.V. Okunev, D.M. Irodov, V.A. Kordium. Utilization of Protein Splicing for Purification of the Human Growth Hormone // Molecular biology (Moscow), 2008, Vol. 42, No. 6, pp. 966–972. 

  2. Starokadomskyy P.L., Okunev O.V., Dubey L.V. Utilizing of protein splicing phenomenon for optimization of obtaining and purification of the recombinant human growth hormone // Eur J Medic Res., 2006, Oct. 8, vol.11 (17th  European students’ Conference, 8-12 October 2006, Berlin)– p. 128-129.

  3. Starokadomskyy P.L. Protein splicing // Molecular biology (Moscow), 2007, vol. 41, N2, p. 278-293 (PMID: 17514899)

  4. Starokadomskyy P.L., Dubey I.Ya., Okunev O.V., Irodov D.M. Intein-containing chimeric protein construction and evaluation of its cleavage conditions // Cytology and Genetics, 2007, vol. 41, N2, p. 3-11 (PMID: 17494337)

  5. Starokadomskyy P. L. Protein splicing and its evolution in eukaryotes // Biopolymers and cell. 2010; 26 (1): 5 - 12 

На русском/украинском:

  1. Старокадомский П.Л., Окунев О.В., Дубей И.Я. Использование белкового сплайсинга для оптимизации получения и очистки рекомбинантных белков // Материалы Международной конференции «Генетика в России и мире», 28.06-2.07 2006, Москва, Россия, с. 192.

  2. Старокадомський П. Л., Яворський В.Ю. Використання білкового сплайсингу для оптимізації отримання та очистки рекомбінантних білків // Тези конференції-конкурсу робіт молодих вчених «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2006», присвяченої 100-річчю з Дня народження Беліцера, 4-7 червня 2006, Київ, Україна, с. 29.

  3. Старокадомский П.Л. Белковый сплайсинг (теория) // Молекулярная биология (Москва), 2007, том 41, N 2, c. 314–330. 

  4. Старокадомский П.Л. Белковый сплайсинг (теория, биотехнология) // Укр. биох. журн., 2005, №4, с.14-29. (PMID: 16568601)

Популярная статья:

    1.  Старокадомский П.Л. Белки против РНК — кто первым придумал сплайсинг? Biomolecula.ru (ссылка)

   РИСУНКИ ПО ТЕМЕ:

        сравнительный анализ пространственного расположения боковых радикалов аминокислот активного центра сериновых протеаз и интеина Mxe GyrA, сделанный в нашей лаборатории.

        схема белкового цис-сплайсинга                                           

        схема белкового транс-спласинга

    ПОЛЕЗНЫЕ ССЫЛКИ ПО ТЕМЕ:

        InBase - веб-портал посвященный интеинам: теория, последовательности, библиография, ссылки. Сайт размещен на сайте New England Biolab. Координатор сайта - Dr Francine Perler,  ведущий исследователей феномена белкового сплайсинга http://www.neb.com/neb/inteins.html  (прямая ссылка на лист моих публикаций на InBase - http://tools.neb.com/inbase/bibliog.php#starokadomskyy2005 )

       

        База по интеинам и их гомологам (BIL's, Hedgehog), размещена на сайте лаборатории Shmuel Pietrokovski, Weizmann Institute, Israel.  http://bioinformatics.weizmann.ac.il/~pietro/inteins/

       

        Популярно о белковой сплайсинге - Biomolecula.ru

Back to the Start Page       Work        Photos          About me           Links